用于體外擴(kuò)增特定的PCR擴(kuò)增儀

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于體外擴(kuò)增特定的DN段。
 PCR技術(shù)主要過(guò)程是，通過(guò)人類(lèi)合成的一小斷單鏈DN段（叫做引物）與模板DNA特定的區(qū)域特異性結(jié)合，進(jìn)而以四種dNTP為底物，通過(guò)DNA聚合酶沿著引物和模板形成的雙鏈部分的3’端聚合形成DN段實(shí)現(xiàn)DNA體外擴(kuò)增的過(guò)程。其中，zui重要的是熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，由于該酶在97度以上的高溫也能保持穩(wěn)定，所以我 們可以通過(guò)94～97度這個(gè)溫度范圍內(nèi)處理DNA形成單鏈，然后降溫（根據(jù)引物不同而有差異，一般為50-55度）直至適量的引物結(jié)合到模板上。zui后溫度提升至72度，聚合酶聚合形成雙鏈DNA。
 經(jīng)典方法
 PCR體系組分
 DNA模板（template），含有需要擴(kuò)增的DN斷。
 2個(gè)引物（primer），決定了需要擴(kuò)增的起始和終止位置。
 DNA聚合酶（polymerase），復(fù)制需要擴(kuò)增的區(qū)域。
 脫氧核苷三磷酸（dNTP），是指4種脫氧核糖核酸，用于構(gòu)造新的互補(bǔ)鏈。
 緩沖體系，提供適合聚合酶行使功能的化學(xué)環(huán)境。
 H2O 為了保持各個(gè)組分的濃度，在體系中加水稀釋
 注意：部分品牌緩沖液不含有Mg2+，那么還需要添加對(duì)應(yīng)濃度的Mg2+。酶請(qǐng)zui后加入，水請(qǐng)zui先加入。
 PCR步驟
 1. DNA變性
 （90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下， 氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。
 2. 退火
 （25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。
 3. 延伸
 （70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性*）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。
 PCR的循環(huán)參數(shù)
 1. 預(yù)變性（Initial denaturation）
 模板DNA*變性與PCR酶的*激活對(duì)PCR能否成功至關(guān)重要，建議加熱時(shí)間參考試劑說(shuō)明書(shū)，一般未修飾的Taq酶激活時(shí)間為兩分鐘。
 2. 循環(huán)中的變性步驟
 循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列*變性，可能的情況下可 縮短該步驟時(shí)間，變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)損害酶活性，過(guò)短靶序列變性不*，易造成擴(kuò)增失敗。
 3. 引物退火（Primer annealing）
 退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴(kuò)增的長(zhǎng)度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做出預(yù)估。
 退火溫度對(duì)PCR的特異性有較大影響。
 4. 引物延伸
 引物延伸一般在72℃進(jìn)行（Taq酶zui適溫度）。但在擴(kuò)增長(zhǎng)度較短且退火溫度較高時(shí)，本步驟可省略 延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長(zhǎng)短而定，一般*在1000 bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1 min/kbp。
 5. 循環(huán)數(shù)
 大多數(shù)PCR含25-40循環(huán)，過(guò)多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。
 6. zui后延伸
 在zui后一個(gè)循環(huán)后，反應(yīng)在72℃維持5-15分鐘．使引物延伸*，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。

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